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哺乳動物細胞基因編輯

CRISPR-Cas9基因編輯技術的出現(xiàn)為哺乳動物模型構建提供了簡便、快速的方法，也為基因疾病的治療提供新思路、新方法。泓迅生物繼質粒DNA后全新推出CRISPR RNP介導的細胞基因編輯服務：平臺依托先進的技術和經驗豐富的科研團隊，為您打造從方案設計、sgRNA設計及化學合成、高活性重組Cas9蛋白，RNP復合物組裝到敲除細胞系構建的全流程服務。

服務優(yōu)勢

全模式物種CRISPR sgRNA設計
sgRNA化學合成純度高達99%以上
重組Cas9蛋白純度高達99%以上
最快至2周交付

服務詳情

服務項目	交付內容	交付周期
方案設計	專業(yè)的分析報告設計序列	咨詢
合成與組裝	化學合成修飾化的sgRNA 高活性、高純度的Cas9蛋白 RNP復合物組裝	咨詢
敲除細胞系構建	多克隆細胞群或單克隆細胞株提供細胞基因型復檢、擴增及凍存	咨詢
驗證	DNA水平檢測蛋白水平檢測	咨詢

服務流程

哺乳動物基因編輯

案例分享查看詳細

1、利用RNP下的雙sgRNA編輯法，實現(xiàn)基因DNA水平片段敲除
案例：對X細胞的A基因進行Exon1-13的片段敲除（KO）
（1）在需求敲除片段兩端分別設計1條高靶向的sgRNA序列，如下圖：
gene KO

（2）將gRNA-A1、gRNA-A2進行化學修飾合成后分別與Cas9蛋白組裝成RNP，轉染至X細胞進行A基因片段序列敲除；

（3）敲除結果檢測如下：
DNA水平-Sanger測序顯示，A基因序列已被敲除，結果如下：

RNP

細胞表型檢測如下圖：A為正常細胞，B為A基因敲除后的突變細胞形態(tài)，表明A基因被敲除。
RNP基因敲除

2、RNP敲除效率遠超傳統(tǒng)質粒法
案例：以AAVS1位點敲除為例，比較質粒（DNA）與RNP的敲除效率
（1）將AAVS1-sgRNA1序列構建帶有Cas9的載體中，轉染細胞后提取基因組DNA，以基因組DNA為樣本進行Sanger測序并結合Synthego ICE分析軟件檢測，結果顯示敲除率為14%；

（2）將AAVS1-sgRNA1 RNP復合物轉染細胞后進行如（1）所述檢測，結果顯示敲除效率為69%；
RNP敲除效率

（3）敲除效率比較（如下圖），結果顯示RNP敲除效率是質粒法的4-5倍，顯著高于質粒法。
RNP敲除法

常見問題

常見問題

在哺乳動物細胞基因編輯過程中，需要注意哪些問題？

1.細胞培養(yǎng)與選擇：

選擇適當?shù)牟溉閯游锛毎愋?，如CHO（中國倉鼠卵巢）細胞系、NS0和Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞、HEK293（人胚胎腎293）細胞等，根據實驗目的和需要選擇適合的細胞系。

2.確保細胞的質量和純度，采用合適的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基，以維持細胞的正常生長和分裂。

靶位點的選擇與sgRNA的設計：

3.仔細選擇目標基因的編輯位點，確保編輯后的基因序列符合預期效果，并避免對細胞造成過大的毒性或致死效應。

4.設計特異性強的sgRNA，確保CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠準確識別和切割目標DNA序列。

5.Cas9/sgRNA載體的構建與驗證：

構建哺乳動物細胞Cas9/sgRNA載體，并驗證其活性和效率?？梢酝ㄟ^轉染細胞并檢測基因編輯效果來評估載體的有效性。

6.細胞轉染與篩選：

使用合適的轉染方法將Cas9/sgRNA載體導入哺乳動物細胞中，確保轉染效率和基因編輯效率。通過篩選特定表型的細胞，如藥物抗性、熒光表達等，來富集基因編輯成功的細胞。

基因編輯效果的檢測：

7.采用基因組測序（NGS）等技術檢測基因編輯效果，包括目標位點的突變情況、脫靶效應等。確保編輯結果符合預期，并避免非目標位點的突變。

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