1. GC含量須在40%到80%之間，以確保sgRNA與目標DNA之間的穩(wěn)定結(jié)合。

2. 確保sgRNA設計中的二級結(jié)構(gòu)較少，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)和聚合酶終止序列。這些結(jié)構(gòu)會影響克隆效率和向?qū)У霓D(zhuǎn)錄。

3. 去除polyA位點，如果以病毒作為遞送工具，這些位點會破壞病毒包裝。

4. 盡量減少錯配，特別是PAM上游的前10個堿基。間隔區(qū)序列的后半部分可容忍錯配，但靠近PAM位點的錯配會破壞結(jié)合和隨后的編輯。

5. sgRNA中的間隔區(qū)序列長度須與正在使用的Cas蛋白相匹配。兩者之間的不一致會嚴重減低編輯效率。

6. 研究并選擇最適合你需求的Cas蛋白。Cas蛋白在識別的PAM序列、切割類型及其他多個因素上存在差異，可能影響編輯性能。

7. 確保sgRNA啟動子的位置不與其他啟動子重疊，比如經(jīng)常用于抗性基因轉(zhuǎn)錄的EF-1a啟動子。與該啟動子重疊會導致sgRNA的轉(zhuǎn)錄效率降低。

以下是一些常用的在線設計sgRNA的網(wǎng)站以及它們的特點：

1.CRISPR Design Tools（https://www.benchling.com/crispr/）：Benchling是基于目標序列的算法來設計sgRNA，考慮了靶向性、特異性和副作用等因素。

2.CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）：CRISPO使用最為廣泛，是基于基因組的算法來設計sgRNA，考慮了靶向性、特異性和副作用等因素，并提供了對設計結(jié)果的詳細分析。

3.CHOPCHOP（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）：CHOPCHOP提供了一個用戶友好的界面，使用了基于基因組的算法來設計sgRNA，也會考慮靶向性、特異性和效率等因素。

4.CRISPRscan（https://www.crisprscan.org/）：使用了基于機器學習的算法來預測sgRNA的效率，并提供了對設計結(jié)果的可視化分析。

可以在篩選文庫質(zhì)粒中插入一個獨特的引物結(jié)合位點