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載體指南

泓迅生物精心編制的載體指南，不僅內(nèi)容詳盡，而且結(jié)構(gòu)清晰，旨在為科研工作者提供一個(gè)便捷的參考工具。在載體指南中，我們?cè)敿?xì)介紹多種類(lèi)型的載體，包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體、克隆載體、表達(dá)載體等。我們針對(duì)每一種載體都進(jìn)行詳盡的闡述，包括其特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)、限制、應(yīng)用等關(guān)鍵信息。

泓迅生物的載體指南是一份寶貴的學(xué)習(xí)資料，它將為您在科研道路上提供有力的支持和幫助。我們期待與您攜手共進(jìn)，共同推動(dòng)生物技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。

一、載體概述

載體

將目的基因（DNA片段）轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞、組織或生物體中以實(shí)現(xiàn)基因克隆、表達(dá)、編輯等一系列功能研究，該方法是生物領(lǐng)域最常用的一種研究方法。在基因工程領(lǐng)域，為避免目的基因DNA片段序列的降解同時(shí)保證功能有效性，在轉(zhuǎn)入細(xì)胞、組織或生物體之前，需要先通過(guò)基因工程技術(shù)將目的基因構(gòu)建在一類(lèi)具有在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制能力的DNA分子上，該類(lèi)運(yùn)輸工具被稱(chēng)為載體（Vector）。其中，工程化的質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。

質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子，常見(jiàn)于原核細(xì)菌及真菌中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，具有分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少等特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)天然質(zhì)粒進(jìn)行元件添加、優(yōu)化等工程化改造，將其轉(zhuǎn)換成基因工程中最常用的載體，也稱(chēng)為質(zhì)粒載體。

功能特點(diǎn)：

　　? 載裝能力：具有外源基因插入位點(diǎn)，外源基因插入該位點(diǎn)后不會(huì)破壞質(zhì)粒載體的功能。
　　? 運(yùn)輸能力：將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
　　? 復(fù)制或整合能力：為目標(biāo)基因提供復(fù)制能力或整合能力。
　　? 具有擴(kuò)增或表達(dá)能力：為目標(biāo)基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要條件。
　　? 具有篩選標(biāo)記。
　　? 具有不相容性：含有相同Ori的2個(gè)不同的質(zhì)粒不能同時(shí)存在于1個(gè)細(xì)胞中。

基本組成元件：

　　（1）復(fù)制起始點(diǎn)（Ori）：一段富含AT和重復(fù)序列的特定序列，通過(guò)招募復(fù)制相關(guān)蛋白啟動(dòng)質(zhì)粒復(fù)制。Ori決定了質(zhì)粒在宿主中的拷貝數(shù)，高拷貝質(zhì)粒（10-60個(gè)拷貝）被稱(chēng)為松弛型復(fù)制質(zhì)粒；低拷貝質(zhì)粒（1-3個(gè)拷貝）被稱(chēng)為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒，通常適用于毒性基因及大片段基因的克隆。只有1個(gè)Ori，表示是原核的克隆或表達(dá)質(zhì)粒；有2個(gè)Ori，則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，即可在原核也可在真核中復(fù)制。注意：具有相同的ori的質(zhì)粒具有不相容性，不可共轉(zhuǎn)染。
　?。?）抗性篩選基因（R）：即抗生素抗性基因，方便后續(xù)通過(guò)抗生素篩選陽(yáng)性克隆。一般克隆發(fā)載體只有1種抗性篩選標(biāo)記，部分穿梭質(zhì)粒具有2種抗性篩選標(biāo)記。注意：原核生物和真核生物中的篩選基因不完全一致，原核生物中常見(jiàn)的有Ampr、Camr、Kanr、Tetr等；真核生物中常見(jiàn)的有Puro、G418、Hygr；原核和真核都可以的篩選基因有Zeocin、Blasticidin。
　　（3）多克隆位點(diǎn)（MCS）：即多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)匯集序列區(qū)，其中的每個(gè)酶切位點(diǎn)在整個(gè)質(zhì)粒載體中只有一個(gè)。MCS區(qū)是外源基因的插入位點(diǎn)，一般位于啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)元件之間。不同載體，MCS所包含的限制性?xún)?nèi)切酶種類(lèi)、數(shù)目不同。注意：插入基因序列過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化效率變低。
　?。?）啟動(dòng)子（P）：通過(guò)與RNApol特異型結(jié)合，啟動(dòng)下游DNA轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，本身不被轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子決定基因表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型及表達(dá)量。根據(jù)在細(xì)胞中啟動(dòng)表達(dá)的形式不同，分為3類(lèi)：組成型/廣譜型啟動(dòng)子，組織/細(xì)胞基因特異性啟動(dòng)子，誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。
　?。?）增強(qiáng)子（Enhancer）：一種增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的順式作用元件，無(wú)方向性。
　?。?）核糖體識(shí)別位點(diǎn)（RBS）：位于mRNA的起始密碼子（AUG）上游，核糖體可以識(shí)別、結(jié)合這段序列并向下尋找ATG以起始蛋白翻譯。在原核生物中表達(dá)載體上的RBS為SD序列(位于AUG前面）；在真核生物中，主要依賴(lài)于mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)，除此之外，IRES元件和2A多肽元件也可作為RBS以啟動(dòng)蛋白表達(dá)。
　　（7）轉(zhuǎn)錄終止子（Terminator）：位于待轉(zhuǎn)錄基因下游的3’端調(diào)控元件之后，主要為多聚腺苷酸化或聚（A）信號(hào)，具有終止轉(zhuǎn)錄功能。原核生物主要為polyA；真核生物如哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的終止子（SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA和rbGlob）包括促進(jìn)聚腺苷酸化和終止的序列基序AAUAAA。

　　（8）引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）：一段短的單鏈DNA序列，可以與PCR擴(kuò)增或測(cè)序的引物結(jié)合，主要用于質(zhì)粒序列的人工檢測(cè)。注意：該類(lèi)位點(diǎn)可以根據(jù)應(yīng)用進(jìn)行靈活設(shè)計(jì)。

二、質(zhì)粒載體分類(lèi)

質(zhì)粒載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因功能表達(dá)，這些載體在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是推動(dòng)合成生物學(xué)、生物醫(yī)藥、基因治療、靶點(diǎn)藥物篩選及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)展的基礎(chǔ)。根據(jù)質(zhì)粒載體的多樣化應(yīng)用，其分類(lèi)也是多樣化的，主要有以下幾種：

1、按照屬性質(zhì)粒載體可分為：病毒載體和非病毒載體。其中，病毒載體是一種利用病毒作為基因傳遞的載體，通常通過(guò)將外源基因插入或替換病毒基因組的方式，將所需的基因輸送至目標(biāo)細(xì)胞中。病毒載體具有高度傳染性和特異性，能夠在宿主細(xì)胞中高效地傳遞和表達(dá)外源基因。

病毒載體的應(yīng)用：

　　（1）基因治療：利用病毒載體將治療性基因?qū)氲侥繕?biāo)細(xì)胞中，用于治療遺傳性疾病、癌癥等疾病。
　　（2）基因編輯：利用病毒載體將基因編輯工具（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）輸送至目標(biāo)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因組的精準(zhǔn)編輯和修飾。
　　（3）疫苗開(kāi)發(fā)：利用病毒載體作為疫苗遞送平臺(tái)，輸送目標(biāo)抗原基因至免疫細(xì)胞中，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
　　（4）基因研究：在基因功能研究、蛋白質(zhì)表達(dá)和藥物篩選等領(lǐng)域，病毒載體用于將特定基因傳遞到細(xì)胞或動(dòng)物模型中，研究其功能和作用機(jī)制。

病毒載體分類(lèi)及比較如下：

載體類(lèi)型	定義	特點(diǎn)	優(yōu)勢(shì)	限制
慢病毒（LV）載體	一種基于慢病毒（如人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1）的基因傳遞系統(tǒng)，去除了病毒的復(fù)制和致病基因，慢病毒載體保留了病毒將遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中特性。	1、整合能力：可將外源基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體DNA中。 2、宿主范圍廣：對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都有感染能力。 3、可穩(wěn)定性表達(dá)。	載荷容量較大：適用于攜帶較大基因片段或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。	潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)：基因整合可能導(dǎo)致插入突變，增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。
腺病毒載體	一種基于腺病毒（Adenovirus）的基因轉(zhuǎn)移工具，腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，能夠在非分裂的細(xì)胞中高效地表達(dá)外源基因，不整合到宿主細(xì)胞基因組中，適合短期表達(dá)。	1、非整合能力。 2、感染范圍廣：能夠感染包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞在內(nèi)的廣泛宿主細(xì)胞。 3、瞬時(shí)表達(dá)。	1、高效感染：能夠在短時(shí)間內(nèi)感染大量細(xì)胞。 2、安全性高：腺病毒載體不整合到宿主細(xì)胞染色體中，無(wú)插入致突變性。 3、高滴度：腺病毒載體可產(chǎn)生高滴度的病毒液，有利于大規(guī)模制備和應(yīng)用。	1、瞬時(shí)表達(dá)：外源基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短，需要多次接種以達(dá)到治療效果。 2、免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)：腺病毒具有較強(qiáng)的免疫原性，可能引發(fā)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，影響治療效果。
腺相關(guān)病毒（AAV）載體	一種基于腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）的基因轉(zhuǎn)移工具，AAV是一種小的、非包膜的單鏈DNA病毒，它與多種腺病毒有關(guān)，但與腺病毒不同，AAV本身不會(huì)引起疾病，因此在作為基因載體時(shí)具有很高的安全性。	1、小型單鏈DNA病毒：基因組DNA＜5 kb，無(wú)包膜。 2、非致病性：AAV自然存在于人類(lèi)中，但并不會(huì)導(dǎo)致任何已知的疾病。	1、安全性高：AAV不會(huì)破壞宿主細(xì)胞的基因組，不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)或病理反應(yīng)。 2、可長(zhǎng)期表達(dá)：AAV可以在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)外源基因。 3、靶向性：AAV有多種血清型，不同的AAV血清型可以靶向不同的細(xì)胞和組織。	1、載體容量有限：AAV的基因組較小，能夠攜帶的外源基因序列長(zhǎng)度有限，通常不超過(guò)4.5 kb。 2、免疫原性：雖然AAV的免疫原性較低，但在部分人群中仍可能引起免疫反應(yīng)。 3、制備成本高：AAV的制備過(guò)程較為復(fù)雜，成本較高。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體	一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移工具，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常來(lái)源于能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的病毒，如人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）經(jīng)過(guò)改造后的形式。	1、RNA病毒：逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒，其基因組以RNA形式存在。 2、逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制：逆轉(zhuǎn)錄病毒利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并整合到宿主細(xì)胞基因組中。	1、穩(wěn)定表達(dá)：由于整合到宿主基因組，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因表達(dá)。 2、較大基因載量：逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠攜帶較大的外源基因序列，通?？蛇_(dá)8-10 kb。 3、感染效率高：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以感染多種類(lèi)型的細(xì)胞，包括一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型。 4、技術(shù)成熟：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)相對(duì)成熟，有多種載體和包裝系統(tǒng)可供選擇。	1、整合位點(diǎn)不確定性：逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)整合到宿主基因組中，可能引起插入突變，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。 2、主要感染分裂細(xì)胞。 3、潛在的免疫反應(yīng)：盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒通常不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但在某些情況下仍可能引發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。

2、按照進(jìn)入受體細(xì)胞的類(lèi)型不同可分為原核載體、真核載體和穿梭載體（即可以存在于原核細(xì)胞，又可存在于真核細(xì)胞）。

3、按照Ori元件不同可分為高拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒。

4、按照載體性質(zhì)不同可分為融合型載體和非融合型載體。融合型載體能夠?qū)⑼庠椿蛘线M(jìn)宿主細(xì)胞的基因組實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，又稱(chēng)為穩(wěn)定型表達(dá)載體；非融合型載體裝載著目標(biāo)基因以游離的形式存在于細(xì)胞中，使得目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中的短暫表達(dá)，又稱(chēng)為瞬時(shí)表達(dá)載體。

瞬時(shí)表達(dá)載體與穩(wěn)定性表達(dá)載體比較如下：

質(zhì)粒類(lèi)型	工作原理	導(dǎo)入細(xì)胞方法	特點(diǎn)	優(yōu)勢(shì)	限制	應(yīng)用
瞬時(shí)表達(dá)載體	游離于細(xì)胞中，帶動(dòng)目標(biāo)基因在短時(shí)間內(nèi)快速表達(dá)并達(dá)到高峰，隨后逐漸降低。	病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等。	篩選標(biāo)記基因是非必須元件；表達(dá)快速、操作簡(jiǎn)單。	表達(dá)快速、操作簡(jiǎn)單、靈活、成本低	1、可能觸發(fā)細(xì)胞防御機(jī)制，導(dǎo)致基因沉默； 2、高效表達(dá)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性； 3、表達(dá)非永久且不穩(wěn)定。	快速分析基因的功能或蛋白活性。
穩(wěn)定表達(dá)載體	將目標(biāo)基因整合在宿主細(xì)胞基因組后使得目標(biāo)基因持續(xù)且穩(wěn)定性表達(dá)。	病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等	篩選標(biāo)記基因是必須元件；持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)	長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)水平可控、遺傳穩(wěn)定性、安全性高、可重復(fù)性好	1、轉(zhuǎn)化效率低； 2、細(xì)胞篩選周期長(zhǎng)、成本高； 3、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化條件苛刻	在基因工程、細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如重組蛋白生產(chǎn)、基因功能研究、基因治療藥物開(kāi)發(fā)等。

5、按照功能不同可分為克隆載體、表達(dá)載體、基因編輯載體、表達(dá)調(diào)控載體、體外轉(zhuǎn)錄載體及功能檢測(cè)載體等。

? 克隆載體查看詳細(xì)

? 表達(dá)載體查看詳細(xì)

主要元件組成：除了克隆載體的基本元件，還須具備轉(zhuǎn)錄/翻譯所必須的DNA元件，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄生成RNA，合成的RNA在轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)下停止轉(zhuǎn)錄。

（1）根據(jù)啟動(dòng)子類(lèi)型可分為組成型表達(dá)載體、組織特異性表達(dá)載體和誘導(dǎo)表達(dá)載體，比較如下：

載體類(lèi)型	特點(diǎn)	優(yōu)勢(shì)	限制	應(yīng)用
組成型表達(dá)載體	能在多種細(xì)胞類(lèi)型或生物體中實(shí)現(xiàn)基因的持續(xù)表達(dá)。	表達(dá)量高；構(gòu)建及使用較為簡(jiǎn)單；通用性：不受細(xì)胞類(lèi)型限制	缺乏調(diào)控性：基因過(guò)表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；持續(xù)表達(dá)，消耗過(guò)量細(xì)胞資源，影響細(xì)胞的正常生理功能。	通過(guò)基因亞細(xì)胞定位及過(guò)表達(dá)研究基因功能；提高基因表達(dá)量以獲得大量目標(biāo)蛋白
組織特異性表達(dá)載體	在特定的細(xì)胞類(lèi)型、發(fā)育階段或環(huán)境條件下，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇性表達(dá)。	特異性表達(dá)：能夠在特定的細(xì)胞類(lèi)型、組織類(lèi)型下實(shí)現(xiàn)外源基因的特異性表達(dá)，而不影響其他細(xì)胞或組織。特定調(diào)控元件：如組織特異性啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)子或響應(yīng)元件等，用于調(diào)控外源基因的表達(dá)。	復(fù)雜性：需要設(shè)計(jì)和構(gòu)建特異性調(diào)控元件，相對(duì)比較復(fù)雜，需要一定的技術(shù)和資源支持。表達(dá)水平波動(dòng)：外源基因的表達(dá)水平可能不夠穩(wěn)定，需要進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)控元件以提高表達(dá)的穩(wěn)定性。	適用于多種研究或應(yīng)用領(lǐng)域，如基因治療、基因調(diào)控、生物傳感等。
誘導(dǎo)表達(dá)載體	含有特定的誘導(dǎo)或響應(yīng)元件，在特定的外部信號(hào)或誘導(dǎo)劑的作用下，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控性表達(dá)。	精確調(diào)控：可精確控制基因表達(dá)的時(shí)間和強(qiáng)度，有助于避免非特異性效應(yīng)。節(jié)省成本：只在必要時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，避免了持續(xù)表達(dá)可能造成的資源浪費(fèi)。靈活性高：能夠根據(jù)需要選擇不同的誘導(dǎo)條件，實(shí)現(xiàn)外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)或抑制。	操作復(fù)雜：需要精確控制誘導(dǎo)劑的添加時(shí)間和濃度，以及可能需要考慮誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的影響。誘導(dǎo)條件限制：誘導(dǎo)型表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)通常受到特定條件的限制，可能不適用于所有研究或應(yīng)用場(chǎng)景。表達(dá)水平波動(dòng)：不同實(shí)驗(yàn)條件下，表達(dá)水平可能存在波動(dòng)，需要精細(xì)調(diào)控。	適用于特定條件下基因功能研究及蛋白的表達(dá)。

（2）根據(jù)啟動(dòng)子來(lái)源可分為哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、大腸桿菌表達(dá)載體等。

（3）根據(jù)目標(biāo)基因類(lèi)型可分為常規(guī)基因表達(dá)載體、重組蛋白表達(dá)載體、非編碼RNA表達(dá)載體、抗體蛋白表達(dá)載體等。

常規(guī)基因表達(dá)載體、重組蛋白表達(dá)載體、非編碼RNA表達(dá)載體及抗體蛋白表達(dá)載體比較如下：

載體類(lèi)型	目標(biāo)基因	特點(diǎn)	限制	應(yīng)用
常規(guī)基因表達(dá)載體	未知功能的基因或特定序列	具有篩選marker或報(bào)告基因元件：通過(guò)篩選marker或報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)基因的亞細(xì)胞定位或?qū)崿F(xiàn)基因過(guò)表達(dá)或恢復(fù)表達(dá)。	免疫原性：部分表達(dá)載體會(huì)使宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致載體被清除或細(xì)胞死亡。	基因的功能研究
重組蛋白表達(dá)載體	編碼目標(biāo)蛋白的基因序列	根據(jù)目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)出的基因序列，不一定是天然存在的；含有目標(biāo)蛋白篩選、純化的特定標(biāo)簽元件；具有多樣化的蛋白表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)細(xì)胞等。啟動(dòng)子多為誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子；具有良好的擴(kuò)展性：從實(shí)驗(yàn)級(jí)別到工業(yè)級(jí)別。	1、成本高:從載體構(gòu)建到蛋白純化。 2、放大困難：主要受困于細(xì)胞生長(zhǎng)條件、產(chǎn)物穩(wěn)定性維持等。 3、部分蛋白因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以正確折疊或易被宿主細(xì)胞降解等原因而無(wú)法高效表達(dá)。
非編碼RNA表達(dá)載體	miRNA、siRNA、lncRNA或circRNA等多種類(lèi)型	特異性：針對(duì)特定的基因或RNA分子進(jìn)行RNA序列選擇及設(shè)計(jì)。	1、引發(fā)免疫反應(yīng)； 2、出現(xiàn)非特異性調(diào)控； 3、穩(wěn)定性差：非編碼RNA 在體內(nèi)的穩(wěn)定性較低	1、調(diào)控基因表達(dá)； 2、可作為研究非編碼RNA生物學(xué)功能的有利工具； 3、具有治療某些由異常基因表達(dá)引起的疾病
抗體蛋白表達(dá)載體	編碼特定抗體的基因序列，包含編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA片段	靈活性強(qiáng):可表達(dá)多種類(lèi)型的抗體，包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體等。通過(guò)改造和優(yōu)化載體，還可以實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)、融合蛋白表達(dá)等高級(jí)應(yīng)用。	1、表達(dá)效率的不穩(wěn)定性：載體表達(dá)效率受到宿主細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)條件、基因序列等因素導(dǎo)致表達(dá)效率的不穩(wěn)定。 2、活性不易控制：抗體聚集和錯(cuò)誤折疊而失去活性。 3、純化成本高：昂貴的純化試劑和設(shè)備，增加了抗體生產(chǎn)的成本。 4、宿主細(xì)胞的安全性：某些宿主細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）進(jìn)行抗體表達(dá)時(shí)，可能攜帶病毒、細(xì)菌或其他病原體，需要嚴(yán)格的生物安全措施來(lái)確保生產(chǎn)過(guò)程中的安全。	抗體藥物研發(fā)

主要功能與應(yīng)用：

（1）基因表達(dá)與功能研究：在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因，并研究該基因在宿主細(xì)胞中的功能。這種技術(shù)對(duì)于理解基因在生物體內(nèi)的作用機(jī)制、基因功能發(fā)現(xiàn)等具有重要意義。

（2）蛋白生產(chǎn)：用于生產(chǎn)具有特定功能的蛋白質(zhì)。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞和表達(dá)載體，可以高效地表達(dá)并純化目標(biāo)蛋白，用于生物制藥、診斷試劑、工業(yè)酶等領(lǐng)域。

（3）基因療法：在基因治療領(lǐng)域，表達(dá)載體可將正常的基因?qū)氲交颊叩募?xì)胞中，以替換或修復(fù)缺陷基因。通過(guò)這種表達(dá)載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)基因在患者細(xì)胞中的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。

（4）疫苗開(kāi)發(fā)：表達(dá)載體將抗原基因?qū)胩囟ㄋ拗骷?xì)胞中表達(dá)，誘發(fā)免疫反應(yīng)可以制備出具有免疫原性的抗原蛋白。這些抗原蛋白可以用于制備疫苗，預(yù)防和控制傳染病的發(fā)生。

? 編輯載體查看詳細(xì)

編輯載體（Editing Vector）是一種用于基因編輯的分子工具，它通?；谫|(zhì)粒（plasmid）或其他DNA載體系統(tǒng)，并攜帶特定的基因編輯元件，如DNA核酸酶、識(shí)別序列以及模板DNA等，用于在目標(biāo)生物體的基因組中進(jìn)行精確的DNA序列修改。編輯載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建需要高度的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和技能，以確保編輯的精確性和效率。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，編輯載體在生物醫(yī)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景越來(lái)越廣闊。

主要功能與應(yīng)用：

（1）基因敲除：通過(guò)DNA核酸酶在特定位置切割DNA，然后依賴(lài)細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制（如非同源末端連接）來(lái)刪除或破壞基因。

（2）基因敲入：在DNA切割后，通過(guò)提供模板DNA來(lái)引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行同源重組，從而在特定位置插入新的DNA序列。

（3）基因修復(fù)：類(lèi)似于基因敲入，但用于修復(fù)已存在的突變或缺陷。

根據(jù)編輯對(duì)象不同，主要分為CRISPR Cas9敲除載體和CRISPR Cas13敲除載體，比較如下表：

載體類(lèi)型	定義	特點(diǎn)	編輯對(duì)象	限制
CRISPR Cas9敲除載體	一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因敲除（Knockout，Ko）工具。載體上的Cas9蛋白來(lái)源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，能夠精確地識(shí)別和切割目標(biāo)DNA序列，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除。	1、靈活性：載體構(gòu)建技術(shù)易于操作，可以通過(guò)改變Cas9蛋白的序列實(shí)現(xiàn)對(duì)不同DNA序列的剪切。 2、廣泛適用性：載體構(gòu)建技術(shù)可廣泛應(yīng)用于各種生物體系，包括細(xì)菌、酵母、植物、動(dòng)物等。	DNA	1、脫靶效應(yīng)：存在一定的脫靶效應(yīng)。 2、基因組不穩(wěn)定性：引起的DNA斷裂和修復(fù)可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性，增加突變的風(fēng)險(xiǎn)。 3、致癌風(fēng)險(xiǎn)：研究表明，CRISPR Cas9-Ko載體可能引發(fā)某些類(lèi)型的癌癥。
CRISPR Cas13敲除載體	Cas13是一種能夠切割RNA的CRISPR相關(guān)蛋白，具有高度的RNA識(shí)別和切割能力，能夠精確地識(shí)別和切割目標(biāo)RNA序列。	1、靈活性：Cas13-Ko載體可以靈活地針對(duì)不同的RNA序列進(jìn)行編輯，只需要更換相應(yīng)的crRNA即可。 2、安全性：Cas13-Ko載體在RNA水平下進(jìn)行編輯，不會(huì)改變基因組DNA序列，因此避免了可能由DNA編輯引起的脫靶效應(yīng)和基因突變等風(fēng)險(xiǎn)。此外，Cas13-Ko載體在編輯過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少，對(duì)細(xì)胞毒性較低，進(jìn)一步提高了其安全性。	RNA	1、脫靶效應(yīng)：盡管CRISPR Cas13在RNA識(shí)別方面具有較高的特異性，但仍存在一定的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。 2、長(zhǎng)期效果和安全性：CRISPR Cas13-Ko載體在RNA編輯方面的長(zhǎng)期效果和安全性仍需要進(jìn)一步研究和評(píng)估。

? 表達(dá)調(diào)控載體查看詳細(xì)

表達(dá)調(diào)控載體通常包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等必須的順式調(diào)控元件，以及一個(gè)或多個(gè)用于插入目標(biāo)基因的多克隆位點(diǎn)。通過(guò)設(shè)計(jì)這些調(diào)控元件，研究人員可以精確地控制目標(biāo)基因在特定時(shí)間、特定組織或特定條件下的表達(dá)水平。

主要功能與應(yīng)用：

（1）基礎(chǔ)科學(xué)研究：通過(guò)構(gòu)建表達(dá)調(diào)控載體，可以精確地控制目標(biāo)基因在特定時(shí)間或特定細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)，從而深入研究該基因在生物體中的功能。

（2）代謝工程：通過(guò)精確控制關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或改變其代謝產(chǎn)物的比例。

（3）醫(yī)藥研發(fā)：通過(guò)調(diào)控治療基因的表達(dá)來(lái)糾正或補(bǔ)償缺陷基因的功能，實(shí)現(xiàn)疾病的基因治療。

（4）作物改良：通過(guò)提高抗旱、抗病或抗蟲(chóng)基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)作物的抗逆性。

　根據(jù)調(diào)控表達(dá)形式主要分為CRISPRi載體及CRISPRa載體。詳情如下表：

載體類(lèi)型	特點(diǎn)	關(guān)鍵元件	工作原理
CRISPRi載體	用CRISPR/Cas系統(tǒng)從阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始來(lái)抑制或沉默特定基因的表達(dá)； CRISPRi介導(dǎo)的敲低是可誘導(dǎo)且可逆的。	dCas9、sgRNA、KRAB	主要依賴(lài)于dCas9（沒(méi)有切割活性的Cas9）和sgRNA（單鏈引導(dǎo)RNA）的復(fù)合物。當(dāng)這個(gè)復(fù)合物被引導(dǎo)到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）時(shí)，dCas9能夠物理性地阻礙RNA聚合酶的通過(guò)，導(dǎo)致基因沉默。同時(shí)，dCas9可以融合一個(gè)基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率。這種結(jié)構(gòu)域可以阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而抑制基因的表達(dá)。
CRISPRa載體	利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理進(jìn)行基因激活表達(dá)；	dCas9、sgRNA、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（如VP64或p65AD）	將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（如VP64或p65AD）融合，形成一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活功能的Cas9-激活域融合蛋白。當(dāng)這個(gè)融合蛋白與sgRNA結(jié)合時(shí)，它可以被引導(dǎo)到目標(biāo)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)段，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的作用，促進(jìn)RNA聚合酶的招募和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的激活。

? 體外轉(zhuǎn)錄載體查看詳細(xì)

體外轉(zhuǎn)錄（In Vitro Transcription，IVT）載體，又稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄載體，是一種在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用純化的DNA作為模板，在試管或其他容器中進(jìn)行的RNA合成過(guò)程。主要用于生產(chǎn)和研究RNA分子。

主要功能與應(yīng)用：

（1）mRNA疫苗和免疫治療：通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，可以制備出編碼特定抗原的mRNA，這些mRNA可以在體內(nèi)被細(xì)胞攝取并翻譯成蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種傳染病和腫瘤的疫苗研發(fā)中。

（2）基因功能研究：在分子生物學(xué)和生物技術(shù)的基礎(chǔ)研究和教學(xué)領(lǐng)域，體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是一種重要的實(shí)驗(yàn)工具。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，可以幫助學(xué)生和研究人員更深入地理解RNA的合成、加工和功能機(jī)制。

（3）生物合成和代謝工程：用于生產(chǎn)具有特定功能的RNA分子，如RNA酶、RNA適配體等。這些RNA可以用于生產(chǎn)特定的生物活性物質(zhì)或調(diào)節(jié)代謝途徑。

（4）診斷與檢測(cè)：還可以用于生產(chǎn)標(biāo)記有放射性同位素或其他探針的RNA分子，通過(guò)檢測(cè)特定RNA分子的表達(dá)水平或結(jié)構(gòu)變化，可以判斷疾病的發(fā)病機(jī)制和病情進(jìn)展。

根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同主要分為RNA體外轉(zhuǎn)錄載體和mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體。詳情如下表：

載體類(lèi)型	必須元件	IVT產(chǎn)物
RNA體外轉(zhuǎn)錄載體	T7啟動(dòng)子	RNA
mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體	T7啟動(dòng)子、Kozark序列、5’UTR、3’UTR、polyA	mRNA

優(yōu)勢(shì)：

（1）高效快速：可以在短時(shí)間內(nèi)合成出大量的RNA/mRNA分子，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

（2）高純度：通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成的RNA/mRNA分子純度高，不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分離和純化步驟。

（3）靈活性：可以合成各種長(zhǎng)度和序列的RNA/mRNA分子，適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求。

（4）可控性強(qiáng)：體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行控制，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整反應(yīng)條件和時(shí)間。

（5）適用于大規(guī)模生產(chǎn)：由于體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的高效性和可控性，它適用于大規(guī)模生產(chǎn)RNA分子，如mRNA疫苗的生產(chǎn)等。

限制：

（1）穩(wěn)定性受限：體外轉(zhuǎn)錄的RNA/mRNA分子在保存和運(yùn)輸過(guò)程中可能受到溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。

（2）可能產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物：在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，可能會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的RNA產(chǎn)物，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（3）不適用于所有類(lèi)型的RNA合成：雖然體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以合成多種類(lèi)型的RNA分子，但對(duì)于某些特殊的RNA結(jié)構(gòu)或功能可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效合成。

? 啟動(dòng)子功能檢測(cè)載體查看詳細(xì)

? 蛋白互作檢測(cè)載體查看詳細(xì)

蛋白互作檢測(cè)通常通過(guò)構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中目標(biāo)蛋白序列與報(bào)告基因或標(biāo)簽序列融合，并在宿主細(xì)胞中共表達(dá)這兩個(gè)融合蛋白。當(dāng)這兩個(gè)融合蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，它們能夠激活或抑制與它們相連的報(bào)告基因，從而引發(fā)可測(cè)量的信號(hào)變化，如熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或顏色的改變。通過(guò)檢測(cè)這些信號(hào)變化，研究人員能夠評(píng)估并量化蛋白質(zhì)之間的相互作用。

關(guān)鍵元件：

目標(biāo)基因插入位點(diǎn)、用于報(bào)告蛋白互作的報(bào)告系統(tǒng)元件。

特點(diǎn)：

（1）雙報(bào)告基因系統(tǒng)：通常包含兩個(gè)報(bào)告基因，用于監(jiān)測(cè)蛋白間的相互作用。

（2）融合標(biāo)簽：載體設(shè)計(jì)包含融合蛋白標(biāo)簽，如GST、His或Flag，便于蛋白的純化和檢測(cè)。

（3）信號(hào)放大：一些載體通過(guò)信號(hào)放大機(jī)制提高檢測(cè)的靈敏度。

優(yōu)勢(shì)：

（1）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白互作的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

（2）定量分析：提供了一種定量分析蛋白互作強(qiáng)度的方法。

（3）高通量篩選：適用于大規(guī)模篩選實(shí)驗(yàn)，有助于快速識(shí)別互作蛋白。

（4）應(yīng)用廣泛：可用于藥物篩選、疾病機(jī)制研究和信號(hào)傳導(dǎo)途徑分析。

限制：