CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種物種和領(lǐng)域的研究，顯著提高了基因組編輯的效率。傳統(tǒng)的sgRNA傳遞方法包括質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染，但存在基因插入和免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。目前，直接將Cas9和sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中，具有更安全、更快速、脫靶效應(yīng)更低、編輯效率更高的優(yōu)勢。這種方法正逐漸成為CRISPR/Cas9技術(shù)更有效的選擇。
泓迅生物提供專業(yè)的合成技術(shù)，可為基因編輯研究人員提供兩種策略的sgRNA合成服務(wù)：化學(xué)合成和體外轉(zhuǎn)錄。
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圖1. Cas9-sgRNA復(fù)合物 |
圖2. sgRNA的二級結(jié)構(gòu) |
泓迅生物CRISPR-Cas9 sgRNA設(shè)計(jì)中心針對小鼠的多個(gè)基因各設(shè)計(jì)8個(gè)sgRNA后進(jìn)行體外sgRNA轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期短至2天，制備量達(dá)10-20μg，可以極快地滿足相關(guān)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般需求。
一步法合成gRNA DNA模板
1. 將gRNA DNA模板平連至pUC57載體測序，比對結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致。如圖1所示。
圖1.平連結(jié)果與設(shè)計(jì)序列比對圖
2. 將通過體外轉(zhuǎn)錄得到的sgRNA在2%的瓊脂糖中進(jìn)行電泳，可以看到清晰條帶。如圖2所示。
圖2. sgRNA瓊脂糖凝膠電泳圖
3. 我們對其中一條sgRNA序列進(jìn)行驗(yàn)證： 先將sgRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)sgRNA擴(kuò)增引物，經(jīng)過PCR反應(yīng)獲得sgRNA的DNA序列；其次將DNA序列平連至pUC57載體進(jìn)行測序，結(jié)果顯示sgRNA序列正確。如圖3所示。
圖3. sgRNA序列驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖
注：Lane1是sgRNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA；Lane2是經(jīng)DNaseI處理的sgRNA；Lane3是體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板
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