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RNA干擾 | 藥物靶標確認的利器
發(fā)布時間:2024-09-14

RNA干擾(RNAi)是有效沉默或抑制目標基因表達的過程,指利用內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解,從而導致靶基因的表達沉默,產(chǎn)生相應的功能表型缺失。RNA干擾作為一種新型且強大的基因沉默工具,廣泛應用于生物學和治療學研究,特別是針對癌癥或其他疾病治療中的無成藥性靶標。


RNA干擾的發(fā)現(xiàn)歷程

? 1984年,反義RNA被發(fā)現(xiàn)能夠抑制基因的表達,且雙鏈RNA比單鏈RNA效果更佳。

? 1990年,Jorgensen研究小組在研究時,推測外源查爾酮合成酶基因抑制了內(nèi)源基因表達。

? 1992年,Romano和Macino在粗糙鏈孢霉中觀察到類似現(xiàn)象。

? 1995年,Guo和Kemphues在線蟲中也觀察到了RNA干擾現(xiàn)象。

? 1998年,Andrew Z. Fire等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)實驗中揭示雙鏈RNA的抑制效果強于正義或反義RNA,推測存在擴增效應和酶活性參與,并命名為RNA干擾。

 

RNA干擾家族成員

RNA干擾由轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活,表現(xiàn)為小干擾RNA(siRNA)或短發(fā)夾RNA(shRNA)誘導實現(xiàn)靶mRNA降解的基因沉默;小RNA(miRNA)誘導特定mRNA翻譯的抑制;短反義核酸(siRNA和shRNA序列)對鎖定細胞的mRNA進行降解阻斷了該蛋白的進一步表達/聚集,導致其水平的下降,最終實現(xiàn)抑制作用。

siRNA VS miRNA



RNA干擾的技術(shù)要點

siRNA設計

? 嚴格配對:siRNA反義鏈與靶基因需嚴格堿基配對,避免單堿基錯配。

? 特異性:設計siRNA時,確保其與靶基因高度同源,減少與其他基因同源性。

? 序列選擇:

1. 從AUG下游找AA雙核苷酸,及其后19個核苷酸作為模板。

2. 每個基因選4-5個序列,通過生物信息學篩選特異性最強的。

3. 避開5'和3'非翻譯區(qū)及起始密碼子附近,減少調(diào)節(jié)蛋白競爭。

 

siRNA合成    

體外制備

? 化學合成:適用于已知有效序列,成本高,周期長。

? 體外轉(zhuǎn)錄:成本較低,速度快,毒性小,穩(wěn)定性好,效率高。

? RNase III消化:快速經(jīng)濟,用于研究基因功能缺失,可能引發(fā)非特異沉默。


體內(nèi)表達    

1. siRNA表達載體    

多數(shù)siRNA表達載體采用RNA聚合酶III(pol III)啟動子,如人/鼠U6和人H1,這些啟動子擅長在哺乳動物細胞中表達小分子RNA,并以一串(3-6個)U終止轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建時需訂購兩段編碼shRNA的DNA單鏈,退火后克隆至載體pol III啟動子下游,過程耗時數(shù)周至數(shù)月,需測序驗證。該載體優(yōu)點在于長期研究潛力,帶抗生素標記的可持續(xù)抑制靶基因數(shù)周至更久。病毒載體則高效感染細胞,提升轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性和效率,適合基因沉默研究。

最適用于:已知一個有效的siRNA序列,需要維持較長時間的基因沉默。

不適用于:篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作)。


2. siRNA表達框架    

siRNA表達框架(SECs)為PCR產(chǎn)物,集成了RNA pol III啟動子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA及終止位點,無需載體克隆即可直接導入細胞表達。相比傳統(tǒng)載體,SECs省去了克隆、測序等耗時步驟,快速高效,是篩選siRNA及優(yōu)化啟動子-siRNA組合的理想工具。若PCR設計時加入酶切位點,篩選出的高效siRNA可便捷克隆至載體,構(gòu)建穩(wěn)定表達載體,用于長期抑制研究。這個方法的主要缺點是:

(1)PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中;

(2)不能進行序列測定,PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想。

最適用于:篩選siRNA序列,在克隆到載體前篩選最佳啟動子。

不適用于:長期抑制研究(如果克隆到載體后就可以了)。

 

RNA干擾(RNAi)技術(shù)的應用

RNAi因其在基因沉默上的高效與簡便性,成為基因功能研究的利器。它模擬藥物抑制標靶基因(疾病基因)的機制,采用功能丟失(LOF)策略優(yōu)于傳統(tǒng)功能獲得(GOF)法,故在制藥業(yè)中尤為關(guān)鍵,用于藥物靶標驗證。有效的siRNA/shRNA不僅助力靶標識別,更可潛力轉(zhuǎn)化為RNAi藥物。

RNAi技術(shù)在藥物靶標發(fā)現(xiàn)與驗證中廣泛應用,企業(yè)常利用RNAi文庫篩選細胞,通過表型變化識別功能基因,如抑制腫瘤生長的基因。若靶標具備成藥潛力(如膜蛋白或分泌蛋白),則進一步開展大規(guī)模藥物篩選。同時,RNAi技術(shù)也用于細胞及動物模型中對靶標的二次驗證。

臨床應用中,雙鏈小分子RNA/siRNA已試用于多種疾病治療,如老年黃斑變性、ALS、類風濕性關(guān)節(jié)炎及肥胖等。在抗病毒及神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缗两鹕。┑闹委熖剿髦?,RNAi療法初顯成效,腫瘤治療領(lǐng)域亦取得進展。

 

泓迅生物

RNAi設計與合成

泓迅生物提供高度定制化的siRNA和miRNA合成服務,通過精湛工藝和嚴格質(zhì)檢確保產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)。我們提供多樣化、經(jīng)化學修飾的siRNA,如磷酸、核糖和堿基修飾,以增強其體內(nèi)穩(wěn)定性和效果。同時,我們也供應多種miRNA產(chǎn)品,包括模擬物、抑制劑和對照品,以滿足不同研究需求。

 

 

參考文獻

DOI: 10.1631/jzus.B1700594.

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