傳染病檢測有兩種方式：檢測病原體或者檢測人體為了抵抗病原體而產(chǎn)生的抗體。其中病原體檢測可通過抗原檢測或者核酸檢測方法進(jìn)行，在COVID-19全球范圍內(nèi)爆發(fā)傳播后，基于分子水平的核酸檢測技術(shù)逐漸成為病原體檢測的重要手段。目前，用于病原體檢測的主流技術(shù)有哪些？一起來看看！

熒光定量RT-PCR技術(shù)

熒光定量RT-PCR技術(shù)是將提取出的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對合成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，再利用熒光探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，通過擴(kuò)增產(chǎn)物中的熒光信號來判斷樣本中是否含有病毒序列。熒光定量RT-PCR技術(shù)是世界各國疾控中心（CDC）采用的金標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測患者樣本中微小病原體，是傳染病病毒傳播早期診斷的主要方法。

圖1 RT-PCR檢測流程圖

逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性的引物來達(dá)到快速擴(kuò)增核酸的目的。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)近年來發(fā)展迅速，擺脫了對熱循環(huán)儀的依賴，在現(xiàn)場診斷方面顯示出較強(qiáng)的優(yōu)越性。目前主流的技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplication，LAMP）、連置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）、滾環(huán)核酸擴(kuò)增技術(shù)（rolling cricle amplification）、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（nucleicacid sequence-based amplification，NASBA）。LAMP具有高度特異性，識別DNA/RNA靶標(biāo)特定位置可高達(dá)8個，也被稱為“八倍鏡”，它是眾多等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中研究和應(yīng)用較為成熟的，在及時(shí)檢測POCT（Point of Care Testing）中發(fā)揮重大作用。NASBA是一種簡單的等溫信號放大法，在監(jiān)測和控制動物疾病傳播方面廣泛應(yīng)用。

圖2 依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）檢測SARS-CoV-2病毒流程圖

NGS測序法

NGS測序法常用的原理是橋式PCR擴(kuò)增，通過模板DNA分子的化學(xué)修飾，將其錨定在納米孔或者微載體芯片上，利用堿基互補(bǔ)配對原則，通過采集熒光標(biāo)記信號或化學(xué)反應(yīng)信號，實(shí)現(xiàn)堿基序列的解讀。NGS一次性可完成幾十萬至幾百萬條序列的測定，可在基因組水平對未知病毒進(jìn)行從頭測序，獲得病原體的基因序列。與RT-PCR相比，NGS可以提供更多的病毒序列和分型信息，是識別未知病原體的有力工具。

圖3 NGS測序法檢測病毒流程圖

CRISPR檢測法

CRISPR檢測法的診斷機(jī)制與基因編輯相似，在sgRNA的引導(dǎo)下，CRISPR-Cas蛋白識別靶標(biāo)序列后，Cas12a、Cas13a和Cas14a內(nèi)切酶被激活，對靶標(biāo)核酸進(jìn)行切割，產(chǎn)生熒光信號，達(dá)到檢測目的。相對于qPCR等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)而言，CRIPSR檢測技術(shù)采取等溫?cái)U(kuò)增與Cas酶的反式切割結(jié)合的方法進(jìn)行檢測，借助sgRNA的特異性識別，即提高等溫?cái)U(kuò)增后的特異性，又實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場快速檢測（POCT）。CRISPR診斷方法被稱為下一代分子診斷技術(shù)，有望引起體外診斷領(lǐng)域的新變革。

圖4 CRISPR-Cas12a系統(tǒng)檢測病毒流程圖

如何選擇檢測方法？

泓迅生物

引物探針設(shè)計(jì)與合成

無論選擇哪種檢測方法，都離不開核心原材料引物探針，高質(zhì)量的特異性引物探針可大大提高實(shí)驗(yàn)效率、檢測準(zhǔn)確性。泓迅生物為您提供高質(zhì)量引物探針設(shè)計(jì)與合成！精準(zhǔn)的引物探針設(shè)計(jì)，先進(jìn)的制造工藝和高效的交付周期，助您迅速開展病原體檢測。我們提供qPCR探針、FISH探針、分子信標(biāo)探針、NGS等不同類型的核酸探針，還可為您提供定制化引物探針設(shè)計(jì)與合成服務(wù)，滿足您在分子診斷領(lǐng)域的各種應(yīng)用需求。

 圖5三種探針示意圖

泓迅案例

引物合成是由單個堿基順次連接合成。每處堿基的合成需要完成脫保護(hù)、縮合連接、乙?；忾]、氧化穩(wěn)定四個步驟，加之化學(xué)反應(yīng)自身的效率問題，最終會導(dǎo)致引物產(chǎn)物無法達(dá)到100%的純度。所以，化學(xué)合成的效率直接影響粗產(chǎn)物的純度，同時(shí)也限制了合成引物的長度（一般超過150nt的引物推薦使用基因合成或其它分子生物學(xué)的方法制備）。

泓迅生物升級純化工藝，優(yōu)化試劑配比，最大限度的分離小分子熒光、失敗的小分子片段和目標(biāo)產(chǎn)物，我們的引物探針產(chǎn)品純化效果優(yōu)于市場平均水平，最高純度可達(dá)98%。

常規(guī)純化后的探針產(chǎn)物	泓迅升級純化工藝后的探針產(chǎn)物

質(zhì)檢結(jié)果顯示，泓迅生物制備的高質(zhì)量探針，MS檢測于理論分子量相同且無N±峰，HPLC檢測純度高達(dá)98%以上，熒光全波長掃描與對應(yīng)參數(shù)一致。

References

【1】Hu WS, Hughes SH. HIV-1 Reverse Transcription. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Oct 1;2(10):a006882. doi: 10.1101/cshperspect.

【2】Sun Y, Yu L, Liu C, Ye S, Chen W, Li D, Huang W. One-tube SARS-CoV-2 Detection Platform Based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 2021 Feb 16;19(1):74. doi: 10.1186/s12967-021-02741-5.

【3】Kia V, Tafti A, Paryan M, Mohammadi-Yeganeh S. Evaluation of Real-time NASBA Assay for the Detection of SARS-CoV-2 Compared with Real-time PCR. Ir J Med Sci. 2022 Jun 6;1–7. doi: 10.1007/s11845-022-03046-2

【4】Deurenberg RH, Bathoorn E, Chlebowicz MA, etc. Application of Next Generation Sequencing in Clinical Microbiology and Infection Prevention. J Biotechnol. 2017 Feb 10;243:16-24. doi: 10.1016/j.

【5】Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR? Cells. 2021 Jul 29;10(8):1931. doi: 10.3390/cells10081931.

【6】 Nowrousian M. Next-generation Sequencing Techniques for Eukaryotic Microorganisms: Sequencing-based Solutions to Biological Problems. Eukaryot Cell. 2010 Sep;9(9):1300-10. doi: 10.1128/EC.00123-10.

【7】 Ortiz-Cartagena C, Fernández-García L, Blasco L, etc. Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification-CRISPR-Cas13a Technology as a Promising Diagnostic Tool for SARS-CoV-2. Microbiol Spectr. 2022 Sep 28:e0239822. doi: 10.1128/spectrum.02398-22.