RNA干擾（RNAi）是有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的過程，指利用內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。RNA干擾作為一種新型且強(qiáng)大的基因沉默工具，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和治療學(xué)研究，特別是針對癌癥或其他疾病治療中的無成藥性靶標(biāo)。

RNA干擾的發(fā)現(xiàn)歷程

? 1984年，反義RNA被發(fā)現(xiàn)能夠抑制基因的表達(dá)，且雙鏈RNA比單鏈RNA效果更佳。

? 1990年，Jorgensen研究小組在研究時(shí)，推測外源查爾酮合成酶基因抑制了內(nèi)源基因表達(dá)。

? 1992年，Romano和Macino在粗糙鏈孢霉中觀察到類似現(xiàn)象。

? 1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也觀察到了RNA干擾現(xiàn)象。

? 1998年，Andrew Z. Fire等在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）實(shí)驗(yàn)中揭示雙鏈RNA的抑制效果強(qiáng)于正義或反義RNA，推測存在擴(kuò)增效應(yīng)和酶活性參與，并命名為RNA干擾。

RNA干擾家族成員

RNA干擾由轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活，表現(xiàn)為小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶mRNA降解的基因沉默；小RNA（miRNA）誘導(dǎo)特定mRNA翻譯的抑制；短反義核酸（siRNA和shRNA序列）對鎖定細(xì)胞的mRNA進(jìn)行降解阻斷了該蛋白的進(jìn)一步表達(dá)/聚集，導(dǎo)致其水平的下降，最終實(shí)現(xiàn)抑制作用。

siRNA VS miRNA

RNA干擾的技術(shù)要點(diǎn)

siRNA設(shè)計(jì)

? 嚴(yán)格配對：siRNA反義鏈與靶基因需嚴(yán)格堿基配對，避免單堿基錯(cuò)配。

? 特異性：設(shè)計(jì)siRNA時(shí)，確保其與靶基因高度同源，減少與其他基因同源性。

? 序列選擇：

1. 從AUG下游找AA雙核苷酸，及其后19個(gè)核苷酸作為模板。

2. 每個(gè)基因選4-5個(gè)序列，通過生物信息學(xué)篩選特異性最強(qiáng)的。

3. 避開5'和3'非翻譯區(qū)及起始密碼子附近，減少調(diào)節(jié)蛋白競爭。

siRNA合成    

體外制備

? 化學(xué)合成：適用于已知有效序列，成本高，周期長。

? 體外轉(zhuǎn)錄：成本較低，速度快，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。

? RNase III消化：快速經(jīng)濟(jì)，用于研究基因功能缺失，可能引發(fā)非特異沉默。

體內(nèi)表達(dá)    

1. siRNA表達(dá)載體    

多數(shù)siRNA表達(dá)載體采用RNA聚合酶III（pol III）啟動(dòng)子，如人/鼠U6和人H1，這些啟動(dòng)子擅長在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小分子RNA，并以一串（3-6個(gè)）U終止轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建時(shí)需訂購兩段編碼shRNA的DNA單鏈，退火后克隆至載體pol III啟動(dòng)子下游，過程耗時(shí)數(shù)周至數(shù)月，需測序驗(yàn)證。該載體優(yōu)點(diǎn)在于長期研究潛力，帶抗生素標(biāo)記的可持續(xù)抑制靶基因數(shù)周至更久。病毒載體則高效感染細(xì)胞，提升轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性和效率，適合基因沉默研究。

最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長時(shí)間的基因沉默。

不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。

2. siRNA表達(dá)框架    

siRNA表達(dá)框架（SECs）為PCR產(chǎn)物，集成了RNA pol III啟動(dòng)子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA及終止位點(diǎn)，無需載體克隆即可直接導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)。相比傳統(tǒng)載體，SECs省去了克隆、測序等耗時(shí)步驟，快速高效，是篩選siRNA及優(yōu)化啟動(dòng)子-siRNA組合的理想工具。若PCR設(shè)計(jì)時(shí)加入酶切位點(diǎn)，篩選出的高效siRNA可便捷克隆至載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)載體，用于長期抑制研究。這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是：

（1）PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；

（2）不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子。

不適用于：長期抑制研究（如果克隆到載體后就可以了）。

RNA干擾（RNAi）技術(shù)的應(yīng)用

RNAi因其在基因沉默上的高效與簡便性，成為基因功能研究的利器。它模擬藥物抑制標(biāo)靶基因（疾病基因）的機(jī)制，采用功能丟失（LOF）策略優(yōu)于傳統(tǒng)功能獲得（GOF）法，故在制藥業(yè)中尤為關(guān)鍵，用于藥物靶標(biāo)驗(yàn)證。有效的siRNA/shRNA不僅助力靶標(biāo)識(shí)別，更可潛力轉(zhuǎn)化為RNAi藥物。

RNAi技術(shù)在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證中廣泛應(yīng)用，企業(yè)常利用RNAi文庫篩選細(xì)胞，通過表型變化識(shí)別功能基因，如抑制腫瘤生長的基因。若靶標(biāo)具備成藥潛力（如膜蛋白或分泌蛋白），則進(jìn)一步開展大規(guī)模藥物篩選。同時(shí)，RNAi技術(shù)也用于細(xì)胞及動(dòng)物模型中對靶標(biāo)的二次驗(yàn)證。

臨床應(yīng)用中，雙鏈小分子RNA/siRNA已試用于多種疾病治療，如老年黃斑變性、ALS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肥胖等。在抗病毒及神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缗两鹕。┑闹委熖剿髦校琑NAi療法初顯成效，腫瘤治療領(lǐng)域亦取得進(jìn)展。

泓迅生物

RNAi設(shè)計(jì)與合成

泓迅生物提供高度定制化的siRNA和miRNA合成服務(wù)，通過精湛工藝和嚴(yán)格質(zhì)檢確保產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)。我們提供多樣化、經(jīng)化學(xué)修飾的siRNA，如磷酸、核糖和堿基修飾，以增強(qiáng)其體內(nèi)穩(wěn)定性和效果。同時(shí)，我們也供應(yīng)多種miRNA產(chǎn)品，包括模擬物、抑制劑和對照品，以滿足不同研究需求。

參考文獻(xiàn)

DOI: 10.1631/jzus.B1700594.