可以用NNk的一個(gè)混合物，也可以用Trimer引物構(gòu)建基因文庫(kù)。

他設(shè)計(jì)是針對(duì)不同區(qū)域進(jìn)行的一個(gè)設(shè)計(jì)，但是設(shè)計(jì)的條數(shù)是一樣的。SgRNA序列是不一樣的。抑制文庫(kù)是單質(zhì)粒系統(tǒng)，激活文庫(kù)大部分都是雙質(zhì)粒系統(tǒng)。

要先確定客戶是多基因還是單基因，還要確定設(shè)計(jì)幾條。如果說(shuō)按照芯片設(shè)計(jì)價(jià)格是3000，也可以按照條數(shù)收費(fèi)

Trimer引物合成的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，，可以根據(jù)客戶的物種進(jìn)行一個(gè)設(shè)計(jì)。合成的方式效果也好，偏差更低。

一代測(cè)序，轉(zhuǎn)到細(xì)菌上進(jìn)行一個(gè)擴(kuò)大，挑選單克隆去看測(cè)序的結(jié)果是否是在我們?cè)O(shè)計(jì)的序列之內(nèi)。

至少是200-300條，客戶全基因組范圍比較大的話會(huì)設(shè)計(jì)更多。

三保一套餐是我們?yōu)榇_保基因敲除成功而提供的一種服務(wù)。我們承諾，通過(guò)提供三條sgRNA選擇，確保至少有一條sgRNA能夠成功敲除目標(biāo)基因，從而為客戶提供更大的成功率和保障。

我們采用的目的細(xì)胞是HepG2、Hela、293T細(xì)胞，如果有其他細(xì)胞要求，可以選擇定制化服務(wù)。

1. GC含量須在40%到80%之間，以確保sgRNA與目標(biāo)DNA之間的穩(wěn)定結(jié)合。

2. 確保sgRNA設(shè)計(jì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)較少，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)和聚合酶終止序列。這些結(jié)構(gòu)會(huì)影響克隆效率和向?qū)У霓D(zhuǎn)錄。

3. 去除polyA位點(diǎn)，如果以病毒作為遞送工具，這些位點(diǎn)會(huì)破壞病毒包裝。

4. 盡量減少錯(cuò)配，特別是PAM上游的前10個(gè)堿基。間隔區(qū)序列的后半部分可容忍錯(cuò)配，但靠近PAM位點(diǎn)的錯(cuò)配會(huì)破壞結(jié)合和隨后的編輯。

5. sgRNA中的間隔區(qū)序列長(zhǎng)度須與正在使用的Cas蛋白相匹配。兩者之間的不一致會(huì)嚴(yán)重減低編輯效率。

6. 研究并選擇最適合你需求的Cas蛋白。Cas蛋白在識(shí)別的PAM序列、切割類型及其他多個(gè)因素上存在差異，可能影響編輯性能。

7. 確保sgRNA啟動(dòng)子的位置不與其他啟動(dòng)子重疊，比如經(jīng)常用于抗性基因轉(zhuǎn)錄的EF-1a啟動(dòng)子。與該啟動(dòng)子重疊會(huì)導(dǎo)致sgRNA的轉(zhuǎn)錄效率降低。

目前，市面上大多使用的是人基因組sgRNA文庫(kù)，利用基因組sgRNA文庫(kù)的篩選所得結(jié)果更為廣譜但實(shí)驗(yàn)工程量大。而Syno^?人源通路文庫(kù)具有以下特點(diǎn)：

1、基因總數(shù)少，sgRNA文庫(kù)庫(kù)容小，減少實(shí)驗(yàn)工程量及周期

2、Syno^?人源通路 sgRNA文庫(kù)使用目的性強(qiáng)，一般是在已知基因范圍內(nèi)進(jìn)行靶標(biāo)篩選

3、可以選擇多個(gè)pathway同時(shí)進(jìn)行研究

因此，使用Syno^?人源通路 sgRNA文庫(kù)前要清楚自己研究目的及通路基因，根據(jù)需求進(jìn)行選擇單條通路或多條通路sgRNA文庫(kù)組合。

混合池是所有sgRNA質(zhì)?；旌显谝黄?，是默認(rèn)的發(fā)貨形式，客戶可以直接用來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或進(jìn)行慢病毒包裝；陣列板式屬于特色定制化服務(wù)，根據(jù)客戶需求將每種sgRNA質(zhì)粒置于單孔中，呈現(xiàn)陣列式分布以實(shí)現(xiàn)客戶對(duì)文庫(kù)的靈活運(yùn)用。

以下是一些常用的在線設(shè)計(jì)sgRNA的網(wǎng)站以及它們的特點(diǎn)：

1.CRISPR Design Tools（https://www.benchling.com/crispr/）：Benchling是基于目標(biāo)序列的算法來(lái)設(shè)計(jì)sgRNA，考慮了靶向性、特異性和副作用等因素。

2.CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）：CRISPO使用最為廣泛，是基于基因組的算法來(lái)設(shè)計(jì)sgRNA，考慮了靶向性、特異性和副作用等因素，并提供了對(duì)設(shè)計(jì)結(jié)果的詳細(xì)分析。

3.CHOPCHOP（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）：CHOPCHOP提供了一個(gè)用戶友好的界面，使用了基于基因組的算法來(lái)設(shè)計(jì)sgRNA，也會(huì)考慮靶向性、特異性和效率等因素。

4.CRISPRscan（https://www.crisprscan.org/）：使用了基于機(jī)器學(xué)習(xí)的算法來(lái)預(yù)測(cè)sgRNA的效率，并提供了對(duì)設(shè)計(jì)結(jié)果的可視化分析。